Antica azienda agricola,

in provincia di Pavia

Effetto della vinificazione sulla composizione del rosso Il vino come fonte di polifenoli per Biomateriali anti-infettivi

Arianna Di Lorenzo 1, Nora Bloise 2, Silvia Meneghini 1, Antoni Sureda 3, Gian Carlo Tenore 4,

Livia Visai 2,5, Carla Renata Arciola 6,7,* e Maria Daglia 1,*

1. Dipartimento di Scienze del Farmaco, Sezione Chimica Farmaceutica e Tecnologie Farmaceutiche,

Università di Pavia, V.le Taramelli 12, Pavia 27100, Italia;

2. Dipartimento di Medicina Molecolare, Centro Tecnologie per la Salute (CHT), UdR INSTM, Università di Pavia,

Viale Taramelli 3/b, Pavia 27100, Italia;

3. Gruppo di ricerca sulla nutrizione comunitaria e lo stress ossidativo e CIBEROBN

(Fisiopatologia dell'obesità e della nutrizione), Università delle Isole Baleari, Palma di Maiorca, Isole Baleari

4. Dipartimento di Chimica Farmaceutica e Tossicologica, Università degli Studi di Napoli Federico II,

Via D. Montesano 49, Napoli 80131, Italia;

5. Dipartimento di Medicina del Lavoro, Tossicologia e Rischi Ambientali, Fondazione S. Maugeri, IRCCS,

Via S. Boezio 28, Pavia 27100, Italia

6. Unità di Ricerca sulle Infezioni Implantari, Istituto Ortopedico Rizzoli, via di Barbiano 1/10,

Bologna 40136, Italia

7. Dipartimento di Medicina Sperimentale, Diagnostica e Specialistica (DIMES), Università di Bologna,

via San Giacomo 14, Bologna 40126, Italia

Riassunto: i biomateriali che rilasciano battericidi sono attualmente diventati strumenti per contrastare la medicina infezioni associate al dispositivo. Il biomateriale antinfettivo ideale deve contrastare l'infezione mentre

salvaguardare l'integrità delle cellule eucariotiche. Il vino rosso è una bevanda ampiamente consumata a cui molti vengono attribuite proprietà biologiche, compresi gli effetti protettivi contro le infezioni orali e le relative ossa (artrosi, osteomielite, infezioni articolari periprotesiche) e malattie cardiovascolari. In questo studio, quindici campioni di vino rosso derivati da uve autoctone dell'Oltrepò Pavese (Italia), ottenuti dai processi di vinificazione del vino rosso “Bonarda dell'Oltrepò Pavese”, sono stati analizzati a fianco tre campioni ottenuti dalla pigiatura delle vinacce. Contenuto totale di polifenoli e antociani monomerici sono stati determinati ed è stata condotta la profilazione dei metaboliti mediante un'analisi cromatografica. L'attività antibatterica dei campioni di vino è stata valutata nei confronti di Streptococcus mutans, responsabile di carie dentale, Streptococcus salivarius e Streptococcus pyogenes, due patogeni batterici orali. Risultati evidenziato le fasi di vinificazione in cui i campioni presentano il più alto contenuto di polifenoli e la maggiore attività antibatterica. Considerando la necessità globale di nuove armi contro i batteri infezioni e alternative agli antibiotici convenzionali, nonché la bioattività favorevole di polifenoli, i risultati indicano il vino rosso come fonte di sostanze antibatteriche per svilupparne di nuove biomateriali e rivestimenti antinfettivi per dispositivi biomedici.

Introduzione: Prove crescenti suggeriscono che le sostanze antimicrobiche naturali possono essere utilizzate in diversi modi campi come i prodotti alimentari (ovvero, conservanti alimentari e componenti per attivi, intelligenti   imballaggi ecologici), prodotti cosmetici (es. cosmetici per l'igiene orale, come dentifrici e collutori), dispositivi medici e farmaci antimicrobici. Per quanto riguarda quest'ultima questione, i contagi sono le principali cause di morbilità e mortalità nel mondo. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità rapporti, ci sono stati più di 55 milioni di decessi in tutto il mondo nel 2011 con infezione responsabile un terzo di tutti i decessi. L'esposizione a lungo termine agli antibiotici ha portato alla resistenza agli antibiotici di microrganismi; pertanto, negli ultimi anni, molta attenzione è stata dedicata alla scoperta e sviluppo di nuovi agenti antimicrobici naturali che potrebbero agire contro i microrganismi resistenti.

Considerando che la ricerca sui biomateriali è uno dei campi più importanti e in più rapida crescita moderne scienze alimentari e medicina, i prodotti naturali, in particolare di origine vegetale, potrebbero essere nuovi e candidati interessanti per applicazioni di biomateriali. Sono stati diversi film commestibili antimicrobici prodotto per ridurre al minimo la crescita di microrganismi patogeni, compresi quelli a base di proteine (frumento glutine, caseina e proteine del siero di latte, polisaccaridi (chitosano) e lipidi (acilgliceroli). In negli ultimi anni, c'è stato un crescente interesse nell'aggiunta di agenti antimicrobici ai dispositivi medici. Il obiettivi dell'aggiunta sono la riduzione o la prevenzione di un'infezione correlata al dispositivo e la riduzione o inibizione della loro colonizzazione batterica. Ad esempio, le sostanze antimicrobiche (cioè l'olio di timo) hanno stato incorporato nei film di chitosano per potenziali applicazioni nella guarigione delle ferite.

I cibi vegetali hanno suscitato grande interesse come fonti di sostanze antimicrobiche. Tra le secondarie metaboliti presenti nelle piante, polifenoli, terpenoidi, alcaloidi, lectine, polipeptidi e i poliacetileni sono noti per essere agenti antimicrobici. La maggior parte di questi metaboliti sono sicuri e si mostrano tossicità ed effetti collaterali trascurabili. Il tè verde, il mirtillo rosso e il cacao sono considerati i più promettenti fonti vegetali. Molte indagini hanno mostrato che l'uva e i prodotti correlati (succo d'uva e vino) ha portato ad esercitare un'attività antibatterica contro un'ampia gamma di batteri a causa dell'effetto contenuto di polifenoli.

Il vino, principalmente fermentato da uve Vitis Vinifera L., è una bevanda ampiamente consumata a causa di le sue piacevoli proprietà sensoriali. Gli acini d'uva ei loro vini sono caratterizzati da alti livelli di polifenoli, una grande famiglia di metaboliti secondari vegetali considerati responsabili della qualità del vino e i suoi effetti positivi sulla salute umana.

La composizione quali-quantitativa fenolica del vino rosso è influenzata da diversi fattori, quali il vitigno, la posizione del vigneto, le condizioni climatiche e l'esposizione solare, la vinificazione processo e conservazione del vino.

I vini rossi, ottenuti da vitigni a buccia scura, contengono generalmente fino a 3500 mg/ L di sostanze fenoliche tra cui non flavonoidi e flavonoidi, quest'ultimo gruppo che rappresenta una percentuale importante di composti fenolici, con quantità comprese tra 1000 e 1800 mg/ l. Le principali classi rappresentative comuni di flavonoidi

sono flavonoli, diidroflavonoli, antociani, proantocianidine e flavan-3-oli. Antociani e le proantocianidine si accumulano principalmente nella buccia delle bacche e sono responsabili delle proprietà sensoriali (cioè colore, astringenza, amarezza e aroma) e per la stabilità chimica contro l'ossidazione. Inoltre, i tannini sono in grado di formare complessi con le proteine della saliva, conferendo astringenza e struttura alla bevanda finale. I composti non flavonoidi includono acidi idrossicinnamico e idrossibenzoico e acidi fenolici che raggiungono concentrazioni fino a 200 mg/ L nei vini rossi. Altri non flavonoidi minori i componenti sono i fenoli volatili, responsabili degli aromi sgradevoli, e gli stilbeni, con trans-resveratrolo riconosciuto come uno dei componenti caratteristici del vino.

Il vino rosso è tradizionalmente ricavato dalla pigiatura e diraspatura delle uve, con il mosto ottenuto rimanendo a contatto con bucce e semi per un periodo maggiore o minore: in questo modo, lo scioglimento delle sostanze coloranti delle vinacce, ed eventualmente dei raspi, è coadiuvato dalla presenza di alcol prodotto durante la fermentazione. Durante il processo fermentativo, il vino viene spostato da una botte a un altro (svinatura), fino al termine della fermentazione sia alcolica che malolattica.

Oggi la vinificazione tradizionale è stata migliorata grazie alle innovazioni tecnologiche consentendo la produzione di vini di migliore qualità e l'automazione dei processi a seconda del metodo di vinificazione, è possibile ottenere vini con differenti specifiche sensoriali proprietà e diverse quantità di composti bioattivi. L'aggiunta di co-pigmenti prima macerazione fermentativa prolungata, generalmente acidi idrossicinnamici, idrossicinnamoiltartarico acidi e flavonoli, ad esempio, possono essere utilizzati per migliorare la stabilità del colore del vino e per modificarlo tonalità dal rosso porpora al rosso intenso. Durante la macerazione gli antociani del vino entrano in contatto con co-pigmenti, convertendosi da monomeri a polimeri. Un'altra vinificazione la procedura utilizzata per migliorare il contenuto fenolico e le proprietà sensoriali è l'aggiunta di condensato tannini derivati dall'uva. I tannini richiedono un aumento della stabilizzazione degli antociani attraverso il formazione di pigmenti polimerici, fornendo un miglioramento dell'intensità del colore e antiossidante del vino e proprietà di scavenging dei radicali. Inoltre, una nuova tecnica di vinificazione consiste nel lasciare fecce di lievito nel vino dopo la fermentazione alcolica. Questa procedura induce sensibili cambiamenti nel vino aroma, perché le fecce hanno la capacità di adsorbire e rilasciare alcuni composti volatili.

Infine, la criomacerazione è ampiamente utilizzata nella produzione dei vini bianchi ed è stata introdotta di recente tra i trattamenti di vinificazione in rosso. Questa procedura consente una maggiore estrazione di composti fenolici contenuto nelle bucce e di aroma primario. La resa della macerazione prefermentativa a freddo è influenzata

da parametri che descrivono il processo stesso, come la temperatura di lavoro (normalmente compresa tra 5 e 5 C), l'uso di gas criogenico (N2 o CO2) al posto dei gruppi frigoriferi e la durata della criomacerazione periodo. A seconda di questi parametri, i vini rossi criomacerati mostrano solitamente una maggiore intensità aromatica e maggiore stabilità nelle loro proprietà gustative, un migliore profilo qualitativo e un maggiore contenuto di flavonoli (es. quercetina), ma un contenuto inferiore di antociani, catechine e resveratrolo.

Un numero crescente di prove suggerisce che l'assunzione moderata di vino rosso esercita effetti protettivi sulla salute umana, fortemente correlato alla sua composizione polifenolica. I polifenoli sono ben noti antiossidanti e scavenger di radicali liberi. Inoltre, possono inibire alcuni fattori trascrizionali e è in grado di modulare l'attività enzimatica e le vie metaboliche, esercitando così particolari benefici per la salute riguarda malattie croniche degenerative quali patologie cardiovascolari, cancro e diabete e le sue complicanze (vale a dire, retinopatia diabetica).

Studi recenti dimostrano che un consumo moderato di vino rosso è legato anche alla tutela del vino igiene orale. In particolare, Daglia et al. testato l'attività antibatterica di due vini commerciali contro streptococchi orali responsabili direttamente (S. mutans) o indirettamente (S. salivarius) dello sviluppo di carie e contro S. pyogenes responsabile di faringite. I collaudati vini rossi e bianchi erano attivi contro i ceppi testati. Questa attività è stata principalmente attribuita alla presenza di acidi organici (cioè lattico, malico, succinico, tartarico, citrico e acetico). Inoltre, lo stesso gruppo di ricerca ha mostrato il attività anticarie in vitro ed ex vivo del vino rosso, concentrandosi sul suo antibiofilm e antiadesivo proprietà. Il vino rosso dealcolizzato, e in particolare le sue proantocianidine, si è dimostrato forte interferire con l'adesione di Streptococcus mutans alle sfere di idrossiapatite (sHA) rivestite di saliva, promuovendone il distacco da sHA e inibendo potentemente la formazione di biofilm in vitro. Inoltre, la capacità del vino rosso di inibire ex vivo la formazione di biofilm di S. mutans sulla superficie occlusale del naturale sono stati anche mostrati i denti umani. Gli stessi risultati sono stati raggiunti da una ricerca più recente che riferito che il vino rosso esercitava proprietà antimicrobiche in un modello di biofilm di placca sopragengivale, integrato con cinque specie batteriche (es. Actinomyces oris, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus oralis, Streptococcus mutans e Veillonella dispar) comunemente associati a malattie del cavo orale.

Negli ultimi decenni sono state condotte in tutto il mondo numerose indagini sulle malattie del cavo orale perché queste malattie (come la carie dentale e le malattie parodontali) sono gravi problemi di salute che influenzano la qualità della vita e sono legati a patologie sistemiche, come malattie cardiovascolari, artrite reumatoide, osteoporosi e osteomielite.

Diversi composti sintetici sono disponibili in commercio per la salute orale e il trattamento della carie dentale. Tuttavia, queste sostanze possono alterare il microbiota orale e sono responsabili di effetti collaterali (es. diarrea e colorazione dei denti). Inoltre, questi prodotti inducono infezioni non comuni e antimicrobici resistenza, che rappresenta una minaccia mondiale per la salute pubblica globale a causa di nuovi meccanismi di resistenza che continuano ad emergere, aumentando fortemente il rischio di diffusione di malattie resistenti.

Dovrebbero essere messe in atto opzioni alternative di prevenzione e trattamento per la carie dentale per ridurre ulteriormente la carie in tutto il mondo, in particolare nei paesi in via di sviluppo, che necessitano di nuove tecnologie sicure, efficaci ed economiche prodotti per il trattamento delle malattie orali.I fitochimici rappresentano una possibile fonte di prodotti efficaci, economici e agenti anticarie sicuri e sembrano essere un'alternativa adatta.

Anche se ci sono stati cambiamenti nella composizione fenolica durante il processo di vinificazione precedentemente studiati, sono disponibili fino ad oggi pochi studi sul monitoraggio delle proprietà funzionali di vino durante le varie fasi della vinificazione.

La maggior parte degli studi esistenti sono relativi alla valutazione dell'attività antiossidante per mezzo di metodi diversi (es. FRAP, DPPH, test della capacità di assorbimento dei radicali dell'ossigeno (ORAC)). Il scopo di questa ricerca è raccogliere dati combinati sulla determinazione della composizione chimica di vino (profilazione metabolica, contenuto fenolico e antocianico) e valutazione del suo antibatterico proprietà contro i patogeni orali durante il corso della vinificazione, a partire dal pigiato uva fino al termine della fermentazione. La fase più promettente della vinificazione, durante la quale il vino possiede la più alta attività antibatterica, sarà individuato per ottenere estratti utili per la preparazione di prodotti per la salute orale attivi contro le malattie indotte dai batteri testati.

Campioni di vino di un'annata 2015, ottenuti da uve Croatina e Barbera V. Vinifera L. coltivate nell'Oltrepò Pavese, sono stati ottenuti dall'azienda vinicola dell'Oltrepò italiano “I Doria di Montalto” (Montalto Pavese, Pavia, Italia). I campioni di vino Croatina sono stati raccolti in fase di pigiatura dell'uva (30 settembre 2015), ad ogni travaso in vasca di fermentazione ea fine fermentazione (30 ottobre 2015).

Tutti i campioni di vino, la loro data di raccolta, la fase di vinificazione e l'abbreviazione utilizzata in questo documento sono elencati nella tabella 1.

Il vino Croatina si ottiene attraverso un procedimento ideato e sviluppato da “I Doria di Montalto” enologi della cantina, consistente in una iperossigenazione del mosto durante la fermentazione e a micro-ossigenazione durante le fasi post-fermentative.

Successivamente, 48 h dopo l'inizio della fermentazione alcolica in vasche di cemento vetrificate, la temperatura viene controllata a non superare i 27 C. Quindi, 7 giorni dopo l'inizio della fermentazione, le vinacce vengono diraspate

dal mosto e subisce una pigiatura più soffice a 1 atm: il vino ottenuto, denominato Croatina Torchiato, era analizzato in tre diverse fasi di questo processo di vinificazione. Il vino Croatina viene poi travasato per 5 giorni, per consentire la fermentazione malolattica dovuta ai batteri Oenococcus Oeni e Leucococcus.

In conclusione, questo lavoro rappresenta il primo tentativo di indagare i cambiamenti nella sostanza chimica composizione del vino rosso, unitamente ai cambiamenti della sua attività antibatterica, che si verificano durante il processo di vinificazione (compresi pigiatura, fermentazione e pigiatura). Per quanto riguarda la chimica composizione è interessato, le principali variazioni della concentrazione di polifenoli totali e totali gli antociani monomerici sono influenzati positivamente dalla fermentazione alcolica e negativamente influenzato dall'aggiunta di SO2. A fine fermentazione il vino rosso Bonarda ha raggiunto un TPC e Concentrazione di TMA paragonabile ad altri vini rossi nella stessa fase di vinificazione. Metabolita la profilazione non cambia significativamente durante il processo di vinificazione e le differenze misurate può essere spiegato dalle varie condizioni che si verificano durante il processo stesso. Per quanto riguarda l'antibatterico attività, è possibile sintetizzare i risultati descritti come segue:

(i) tutti i vini raccolti durante la vinificazione mostrano un effetto antibatterico contro i ceppi batterici testati;

(ii) il l'effetto può essere considerato ceppo-dipendente, come dimostrato da alcune differenze tra i ceppi batterici;

(iii) gran parte dell'attività antibatterica può essere correlata all'alto contenuto di antiossidanti nel vino;

(iv) nel complesso, il processo di vinificazione non sembra esercitare un cambiamento significativo sull'antimicrobico proprietà dei vini analizzati, come dimostrato da valori di MIC comparabili.

È interessante sottolineare che la Croatina Torchiato (CT), che è un vino caratterizzato da a di minor valore economico e quindi destinata ad un mercato secondario, si rivelò una ricchissima fonte di polifenoli. Con composizione chimica e attività antibatterica simili a quelle registrate vini di qualità superiore e, in considerazione del suo basso costo, il CT potrebbe essere utilizzato come fonte di nuovi antinfettivi agenti per lo sviluppo di biomateriali innovativi e rivestimenti per dispositivi medici e potrebbe essere considerata una valida alternativa ad altri estratti ottenuti da tè, mirtillo rosso e cacao.

Visti nel complesso, i nostri dati indicano che i polifenoli nei vini rossi sono in grado di esercitare un'azione significativa azione antibatterica. Inoltre, i risultati di recenti studi sperimentali mostrano che i polifenoli esprimono

altre attività/bioattività influenti, come antinfiammatori, antiossidanti e membrane cellulari effetti stabilizzanti. Questi risultati suggeriscono che i polifenoli potrebbero essere aggiunti in modo vantaggioso e sicuro ai biomateriali protesici per contrastare la colonizzazione batterica, senza ricorrere all'aggiunta di sostanze chimiche tossiche. Pertanto, in prospettiva, l'incorporazione di polifenoli nei biomateriali può contribuire a una nuova generazione di materiali antinfettivi delicati, privi di tossicità e dotati di interessanti proprietà biologiche.

La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal progetto intitolato “Esperienze di Riso e Vino nella terra dei Longobardi e dei Visconti” approvato dalla Regione Lombardia (Dds n. 11527—12/3/2014). Gli autori ringraziano il vigneto “I Doria di Montalto” (MontaltoPavese, PV) e soprattutto Daniele Manini per aver fornito campioni di vino e averci fornito i tecnici supporto per la stesura della Sezione Materiali e Metodo.